PENGHITUNGAN BAKTERI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) AEROB ( SNI )

PENGHITUNGAN BAKTERI ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) AEROB ( SNI )

1. Tujuan

Instruksi Kerja Metode ini sebagai  upaya untuk menentukan jumlah total bakteri aerob pada produk perikanan.

2. Ruang lingkup

a.      Instruksi Kerja Metode ini meliputi pemeriksaan jumlah total bakteri aerob  dengan metode konvensional.

b.      Penentuan jumlah total bakteri aerob  pada produk perikanan.

3. Acuan

SNI 01-2332.3-2006

Maturin, L., and  Peeler, J. T., 2001. BAM: Aerobic Plate Count. Bacteria. Bacteriological Analytical Manual. USFDA.

4. Bahan

a. Plate Count Agar (PCA)

b. Larutan Butterfield’s phosphate buffered (BFP) / Larutan KH₂PO_4.

5. Alat

a)   Inkubator;

b)   Blender  yang dapat disterilisasi

c)   Botol pengencer;

d)   Cawan petri ;

e)   Tabung reaksi;

f)   Timbangan analitik dengan ketelitian  0,0001 g;

g)  Mikroskop;

h)   Pipet;

i)   Autoclave

6.       Prosedur pelaksanaan

6.1   Persiapan contoh

Contoh ikan ditimbang sebanyak 25 g, di-blender secara aseptis, atau contoh cair sebanyak  25 ml, kemudian dimasukkan dalam wadah atau plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phosphate Buffered. Homogenat ini sebagai 10 ^-1.

Dengan menggunakan pipet steril, ambil 1 ml homogenat di atas dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 9 ml larutan BFP untuk mendapatkan pengenceran 10^-2.  Siapkan pengenceran selanjutnya 10^-3 dengan mengambil 1 ml contoh dari pengenceran 10^-2 ke dalam 9 ml BFP.  Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.  Selanjutnya lakukan hal yang sama untuk pengenceran 10^-4, 10^-5 dst. sesuai kondisi contoh.

 6.2 Tahap analisa

a). Pipet 1 ml dari setiap pengeceran 10^-1, 10^-2,dst dan masukkan ke dalam cawan petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.

b). Tambahkan 12 ml-15ml PCA yang sudah didinginkan dalam hingga mencapai suhu 45 ^OC ± 1 ^oC ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan.

c). Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisis terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35 ^OC.

d). Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer dengan media PCA.

e). Kemudian hitung cawan-cawan yang mempunyai jumlah koloni 25-250 dengan alat penghitung koloni atau “hand tally counter”.

       6.3 Pembacaan dan perhitungan koloni pada cawan petri

  

            a). Cawan yang mengandung jumlah 25 koloni-250 koloni dan bebas spreader.

Catat pengenceran yang digunakan dan hitung jumlah total koloni.  Perhitungan Angka Lempeng Total sebagai berikut :

           

                        ∑C

N = -------------------------------------

        [(1 x n₁) + (0,1 x n₂)] x (d)

       Dengan :

N adalah jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni  per ml atau koloni per g.

∑C adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung

n₁  adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung

n₂  adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung

d   adalah pengenceran pertama yang dihitung.

CONTOH :

Pengenceran                    1:100                                1:1000

Jumlah Koloni              232 dan 244                        33 dan 28

            (232 + 244 + 33 + 28)

N =  -------------------------------------

 [(1 x 2) + (0,1 x 2)] x (10^-2)

                                               

= 537 / [(2 + 0,2)] x (0,01)

                 = 537 / (2,2 x 0,01)

 = 537 / 0,022

                 = 24.409

= 24.000

                =  2.4 x 10⁴ kol/g

b) Jumlah koloni semua cawan kurang dari 25 koloni atau cawan tanpa koloni.

Bila cawan duplo dari pengenceran terendah menghasilkan koloni kurang dari 25, hitung jumlah yang ada pada cawan dari tiap pengenceran. Rata-ratakan jumlah koloni per cawan dan kalikan dengan faktor pengenceran untuk menentukan ALT yang diperkirakan.  Tandai ALT dengan tanda bintang ( pada Tabel no. 3) untuk menandai bahwa penghitungan diluar 25-250 koloni per cawan.

c) Cawan dengan jumlah koloni lebih besar dari 250

Bila jumlah koloni per cawan lebih besar dari 250 pada seluruh pengenceran, hitung koloni-koloni pada cawan untuk memberikan gambaran penyebaran koloni secara representative. Tandai penghitungan ALT dengan tanda bintang untuk menandai bahwa penghitungannya diluar 25-250 koloni per cawan (Tabel no. 4).

d) Spreaders

Penyebaran koloni biasanya dibagi dalam 3 bentuk :

1. Rantai koloni, tidak terlalu kelihatan terpisah, karena disintegrasi rumpun bakteri.
2. Terbentuk lapisan air antara agar dan dasar cawan.

3.       Terbentuk lapisan air pada air sisi atau permukaan agar
 

Bila cawan yang disiapkan untuk contoh lebih banyak ditumbuhi oleh spreader seperti (1) area ditutupi oleh spreader, termasuk total area yang melebihi 50% pertumbuhannya lebih dari 25% laporkan cawan spreader.

Rata-rata jumlahnya untuk pengenceran, laporkan jumlahnya sebagai ALT aerob (Tabel no.5). Jika perlu menghitung  cawan yang berisi spreader yang tidak dibatasi oleh (1) dan (2) dapat dihitung   tiga bentuk spreader sebagai satu pertumbuhan.  Untuk tipe pertama, bila hanya terdapat satu rantai, hitunglah sebagai koloni tunggal. Bila ada satu atau lebih rantai yang terlihat dari sumber lain, hitung tiap sumber itu sebagai satu koloni. Jangan menghitung tiap individu dalam rantai sebagai  koloni yang  terpisah. Tipe 2 dan 3 biasanya dihasilkan dalam bentuk koloni dan dihitung sebagai koloni.  Gabungkan perhitungan koloni dan penghitungan spreader untuk menghitung ALT.

e) Cawan tanpa koloni

Bila cawan dari semua pengenceran tidak menghasilkan koloni, laporkan ALT sebagai kurang dari 1 kali pengenceran terendah yang digunakan. Tandai ALT dengan tanda bintang bahwa penghitungannya diluar 25-250 koloni (Table no.6).

f). Cawan duplo satu dengan 25-250 koloni dan yang lain lebih dari 250 koloni.

Hitung kedua cawan termasuk yang lebih dari 250 koloni dalam  penghitungan ALT (Tabel no.7).

 g). Cawan duplo satu cawan dari tiap pengenceran dengan 25-250 koloni.

Bila 1 cawan dari tiap pengenceran menghasilkan 25-250 koloni dan cawan lain menghasilkan lebih dari 250 koloni atau kurang 25 koloni, hitung keempat (4) cawan yang termasuk cawan yang lebih dari 250 koloni atau kurang dari 25 koloni dalam penghitungan ALT (Tabel no.8).

h). Cawan duplo kedua cawan dari satu pengenceran dengan 25-250 koloni hanya 1 cawan dari pengenceran yang lain dengan 25-250 koloni.

 Bila kedua cawan dari satu pengenceran  menghasilkan 25-250 koloni, hitung keempat (4) cawan yang termasuk cawan yang kurang 25 koloni atau  lebih dari 250 koloni dalam penghitungan ALT (Tabel no. 9).

6.4.  Pelaporan

1).  Bulatkan angka menjadi 2 angka yang sesuai, bila angka ketiga 6 atau diatasnya, maka angka ketiga menjadi 0 dan dan angka kedua naik 1, misal 456 menjadi 460.

2). Bila angka ketiga 4 atau dibawahnya, maka angka ketiga menjadi 0 ada angka kedua tetap, misal 454 menjadi 450

3)  Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dibulatkan menjadi 0 dan angka kedua adalah genap, misal 445 menjadi 440.

4) Bila angka ketiga 5, maka angka tersebut dibulatkan menjadi 0 dan angka kedua naik 1 angka  misal 455 menjadi 460.

7. Dokumentasi

Instruksi Kerja Metode ini disimpan dalam bentuk berkas dan/atau file dalam komputer dengan status legalitas yang sama. Adapun formulir terkait yang digunakan dalam Instruksi Kerja Metode ini adalah  worksheet analis dan LHPS.

Lampiran 1. PETUNJUK PENGHITUNGAN ALT No 10 -2 10 -3 10 -4 ALT/ gram Keterangan (1) (2) (3) (4) (5) (6) 1   175 208 16 17 190.000 Bila hanya 1 pengenceran yang berada dalam batas yang sesuai, hitung jumlah rata-rata dari pengenceran tersebut. 2   224 225 25 30 250.000 Bila ada 2 pengenceran yang berada dalam batas yang sesuai, hitung jumlah  masing-masing dari pengenceran sebelum merata-ratakan jumlah sebenarnya. 3 18 14 2 0 0 0 1.600 Koloni < 25 : Pengenceran terendah kurang dari 25, hitung jumlahnya dan kalikan dengan faktor pengencerannya. Beri tanda * (diluar 25-250) 4     523 487 5.100.000 Koloni > 25: hitung koloni yang ada/ dapat dihitung (representatif). Beri tanda * (diluar 25-250) 5   245 230 35 Spreader 290.000 Bila ada 2 pengenceran diantara (25-250) tetapi ada spreader, hitung jumlahnya dan kalikan dengan faktor pengenceran namun untuk spreader tidak dihitung.

PETUNJUK PENGHITUNGAN ALT No 10 -2 10 -3 10 -4 ALT/ gram Keterangan (1) (2) (3) (4) (5) (6) 6 0 0 0 0 0 0 100 Tanpa koloni: Jumlah ALT adalah kurang dari 1 kali pengenceran terendah. Beri tanda * (diluar 25-250) 7   245 278 23 20 260.000 Koloni dgn 25-250 koloni dan yang lain > 250: Hitung kedua cawan termasuk yang lebih dari 250. Rata-ratakan Jumlahnya. 8   225 255 21 40 270.000 Salah satu plate dengan 25-250 koloni dari tiap pengenceran: Hitung jumlah dari tiap pengenceran termasuk yang < 25, lalu rata-rata jumlah yang sebenarnya. 9   220 240 18 28 230.000 Hanya satu plate yang menyimpang dari tiap pengenceran: Hitung jumlah dari tiap pengencer termasuk yang < 25 atau >250, kemudian rata-rata dari jumlah yang sebenarnya.   260 230 30 28 Catatan : 1.       Koloni yang dihitung dalam batas 25-250 koloni. 2.       Perhitungan angka: a.        Bila angka ketiga dari kiri ≥ 5, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua naik 1 angka. b.       Bila angka ketiga dari kiri ≤ 4, maka angka ketiga menjadi 0 (nol) dan angka kedua tetap.

Lampiran 2. Pembuatan Media 1.     BFP (Butterfield’s buffered phosphate) Larutan stok: Timbang media merk MERCK KH2PO4 sebanyak 34 gram dalam 500 ml akuades, atur pH 7.2 dengan 1 N NaOH, tambahkan akuades sampai volume 1000 ml, homogenkan, sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121OC selama 15 menit. Larutan kerja: pipet 10 ml larutan stok dan tepatkan hingga 1000 ml dengan penambahan akuades, sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121OC selama 15 menit.  Selanjutnya digunakan sesuai dengan keperluan pengujian. 2.     PCA (plate count agar) Ambil Media merk MERCK sebanyak 22,5 gram dilarutkan sampai 1000 ml akuades dalam erlenmeyer yang diberi stirer magnetik, homogenkan lalu dipanaskan hingga mendidih selama 1 menit, sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121OC selama 15 menit. Selanjutnya dituang ke dalam  cawan petri sesuai dengan keperluan pembuatan media.