Pemeriksaan Vibrio cholerae Pada Produk Perikanan

Pemeriksaan Vibrio cholerae Pada Produk Perikanan

1.       Tujuan Instruksi Kerja Metode ini sebagai upaya untuk menentukan bakteri patogen Vibrio cholera pada produk perikanan. 2.       Ruang lingkup a.    Instruksi Kerja Metode ini meliputi pemeriksaan jenis bakteri patogen  Vibrio cholera dengan metode konvensional. b.   Pemeriksaan bakteri patogen  Vibrio cholerae pada produk perikanan. 3.    Acuan SNI 01-2332.4-2006 4.       Bahan dan pereaksi a.         Alkaline Peptone Water (APW) b.        Alkaline Peptone Salt (APS) c.         Arginin  dehyrolase d.        Lysine dekarboksilase e.        MIO medium f.          MR-VP broth g.         Sucrose dan     Arabinose h.        OF  medium  i.           Triple Sugar Iron (TSI) Agar j.          Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose (TCBS) agar k.         Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB) l.           Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA) m.      Tryptone Broth and Tryptone Salt Broths (T1No, T1N1, T1N3, T1N6) n.        Urea broth o.        Mineral atau parafin oil steril p.         NaCl  2 % dan 3%

q.        O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 μg dan 150 μg r.          ONPG disk s.         Pereaksi oksidase t.          Physiological saline 0,85% u.        Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7,4 v.         HCl 1N w.        Larutan NaOH 1N x.          Pereaksi VP y.          Pereaksi pewarnaan Gram z.          Baku pembanding Vibrio cholerae aa.     Anti serum Poly Hikojima Inaba - Ogawa. 5.       Peralatan a.         Inkubator b.        Blender  yang dapat disterilisasi. c.         Botol pengencer; d.        Tabung durham; e.        Cawan petri ; f.          Tabung reaksi; g.         Timbangan analitik dengan ketelitian  0,0001 g; h.        Mikroskop; i.           Pipet j.          Vortex

6.         Prosedur pelaksanaan 6.1   Persiapan contoh Contoh ikan ditimbang sebanyak 25 g, di-blender secara aseptis, atau contoh cair sebanyak  25 ml, kemudian dimasukkan dalam wadah atau plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Alkaline Pepton Water (APW). homogenasi selama 2 - 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 1 : 10.  6. 2 Tahap analisa 6.2.1  Pengkayaan a.         Ambil sebanyak 1 ml dari  homogenat  kedalam tabung tabung yang berisi 9 ml APW. b.        Lakukan pengenceran sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. c.         Inkubasi pada suhu  36°C  ±  1°C selama 6 -  8  jam.  d.        Goreskan  larutan  pengkayaan  (APW)  ke  TCBS  agar. e.        Inkubasikan kembali APW yang telah digoreskan tersebut selama  16  -  24 jam, lalu goreskan kembali ke TCBS agar.

6.2.2  Isolasi a.         Ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif  (keruh), tanpa dikocok,  dari setiap pengenceran sedalam 1 cm dari permukaan cairan dan goreskan ke dalam TCBS agar. b.        Inkubasikan TCBS agar pada   suhu 36°C ± 1°C selama 18  - 24 jam. c.         Amati keberadaan Vibrio cholerae pada TCBS agar. Koloni Vibrio cholerae besar, permukaan halus,  agak  datar,  bagian  tengah  buram  dan  bagian  pinggir  terang,  berwarna  kuning (sukrosa positif). 6.2.3  Pemurnian a.     Secara hati-hati, ambil 3 koloni terduga atau lebih dari setiap TCBS agar, goreskan ke dalam   TSA + 1,5% NaCl ( total mengandung NaCl  2%). b.        Inkubasikan selama 18 jam - 24 jam pada suhu 36°C ± 1°C. 6.2.4  Uji Biokimia Pendahuluan 1)   Uji  oksidase Uji  oksidase  dilakukan  dengan  menggunakan  kertas  oksidase dengan cara menggoreskan koloni TSA + NaCl 1,5 % ke atas permukaan  kertas  oksidase  menggunakan  tusuk  gigi.. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua secara cepat.

2)  Uji sensitifitas  terhadap 0 / 129 vibriostat Ambil 1 ose dengan cepat   dari  TSA + NaCl 1,5 % lalu goreskan ke dalam cawan petri yang berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk 0/129 10 µg dan 150 µg pada goresan yang paling  rapat  dan  inkubasikan  pada  suhu  36°C  ±  1°C  selama  18  -  24  jam.  Amati pertumbuhan disekitar disk. Reaksi sensitif ditunjukkan dengan terbentuknya zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi resisten ditandai dengan adanya pertumbuhan disekeliling disk (R). Vibrio cholerae sensitif terhadap 0 / 129 10 µg dan 150 µg. 3) Triple Sugar Iron (TSI) Agar  Diinokulasikan koloni dari  TSA + NaCl 1,5  % dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak media TSI agar.  Diinkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18- 24 jam. Vibrio cholerae menghasilkan asam (warna kuning) pada agar miring (K jarang),  asam  (warna  kuning)  pada  agar  tegak  dan  tidak  menghasilkan  gas  serta  H2S

4)  Uji ONPG Untuk  uji  ONPG,  digunakan  kultur  dari  TSI  atau  media  lain  yang  mengandung  lactose. Diinokulasikan1 ose kultur dari TSI ke dalam tabung yang berisi 0,5 ml larutan physiological saline. Lalu  masukkan 1 disk ONPG lalu inkubasikan pada suhu 36°C ±  1°C selama  20 menit sampai dengan 1 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada media dalam tabung. 5)  Uji oksidatif - fermentatif (OF) Ambil 1 ose dari TSA + 1,5 % NaCl, diinokulasikan ke dalam 2 tabung OF medium semisolid, lalu salah satu tabung tersebut ditambahkan mineral oil /parafin steril setinggi  ±1 cm . Diinkubasikan pada suhu  36°C  ±  1°C selama  1 -  2 hari. Reaksi oksidatif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning (reaksi asam) pada tabung yang  tidak  ditambahkan  dengan  mineral  oil,  sedangkan  reaksi  fermentatif  ditunjukkan dengan  terbentuknya  warna  kuning  pada  tabung  yang  ditambahkan  mineral  oil.  Asam mengubah media dari warna hijau menjadi kuning. 6). Pewarnaan gram Dibuat pewarnaan gram dari setiap koloni terduga Vibrio cholerae. Kultur diambil  dari TSA miring  + NaCl  1,5  % yang telah diinkubasikan   selama  24 jam.   Bakteri  Vibrio cholerae termasuk gram-negatif, berbentuk batang pendek.

6.2.5  Uji Biokimia  Lanjutan Jika  pada  uji  biokimia  pendahuluan  diatas  ditemukan  reaksi  Vibrio cholerae   yang khas  (reaksi  pada TSI Agar)., maka dilakukan uji biokimia lanjutan dengan cara : digoreskan  kembali  kultur  dari  TSA +  NaCl  1,5  %  ke  TSA +  NaCl  1,5  % yang baru  dan  TSB.  Diinkubasi pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 - 24   jam. Setelah itu dilakukan uji-uji sebagai berikut : 1)  Uji hidrolisis Urea. Ambil  1 ose dari TSA  + NaCl  1,5% lalu inokulasikan ke dalam media Urea. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam. Reaksi positip ditunjukan dengan perubahan warna media dari orange  menjadi  merah  muda.  Vibrio  cholerae  tidak  mempunyai  kemampuan  dalam menghidrolisis Urea (reaksi negatif). 2)  Uji Arginin dihydrolase, Lysine dekarboksilase, dan Ornithin dekarboksilase. Ambil  1 ose dari TSA  + NaCl  1,5% lalu inokulasikan ke dalam 3 tabung media dasar dekarboksilase yang  masing-masing  mengandung  arginin,  lysine  dan  ornithin.  Tambahkan masing-masing tabung dengan mineral oil (parafin) steril setinggi ± 1 cm . Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 4 hari. Lakukan pengamatan setiap hari.  Vibrio cholerae menghasilkan reaksi arginin dihydrolase negatif, sedangkan lysine dan ornithin positif .

3) Uji toleransi terhadap garam Diinokulasikan kultur dari TSB kedalam 3 tabung yang masing-masing mengandung Tryptone Broth 1% yang ditambahkan NaCl 0%; 1%; dan 3% (T1N0, T1N1, T1N3  ). Inkubasikan pada suhu  36°C  ±  1°C,  selama  18  -  24  jam.  Reaksi  positif  ditandai  dengan  terjadinya kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan. Vibrio cholerae tumbuh dalam media T1N0. dan T1N3 . 4) Uji pertumbuhan pada suhu 420C Diinokulasikan  1 ose dari TSB yang telah diinkubasikan selama  24 jam kedalam TSB yang telah dihangatkan dalam  inkubator  42°C. Lalu diinkubasi pada suhu 42°C dalam  inkubator  selama  24  jam.  Reaksi  positif  ditandai  dengan  terjadinya  kekeruhan  yang  menunjukkan adanya pertumbuhan. Vibrio cholerae  mampu tumbuh pada suhu 42°C . 5) Uji  Voges-Proskauer  (VP) Diinokulasikan 1 ose   dari TSA + 1,5% NaCl kedalam MR-VP broth , lalu diinkubasikan pada suhu 36°C  ±  1°C selama  48±2jam. Reaksi  positif ditandai dengan terbentuknya  warna merah muda sampai merah mirah delima (ruby) pada media.  Vibrio cholerae menghasilkan reaksi variabel. 6) Uji fermentasi karbohidrat. Diinokulasikan 1 ose dari TSA + 1,5% NaCl kedalam masing-masing satu tabung  sucrose  dan  arabinosa. Reaksi  positif  fermentasi  karbohidrat  menghasilkan  asam  dan  mengubah  media menjadi kuning .  Vibrio cholerae menghasilkan reaksi  positif pada sukrose dan negatif pada arabinose.

6.2.6  Uji Serologi a.         Ambil 1 ose kultur dari TSA + 1,5% NaCl   yang telah diinkubasikan selama 16 -24 jam   dan letakkan diatas gelas preparat. b.        Tetesi dengan   larutan saline 0,85% dan emulsikan. c.          Letakkan  1  tetes  antiserum  Poly  Hikojima  Inaba-Ogawa  disamping  suspensi koloni. d.        Campurkan   antiserum sedikit demi sedikit   dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. e.        Dilakukan kontrol dengan menggunakan laruran saline dan antiserum. Campuran tersebut digoyangkan  ke kiri dan ke kanan dan amati reaksi penggumpalan pada latar belakang yang gelap sebagai berikut: f.          Positif   apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol. Vibrio cholerae menghasilkan reaksi  positif. g.         Negatif   apabila  tidak  terjadi  penggumpalan  baik  pada  larutan  kultur  maupun  larutan kontrol.

6.3 Interpretasi hasil Tabel   1. Interpretasi hasil No Jenis uji Interpretasi hasil positif Vibrio cholerae 1 Morfologi Gram negatif, bentuk batang 2 TSIA Agar miring: asam (kuning) Agar tegak : asam (kuning) 3 OF medium OF Positif 4 Oksidase Positif 5 Arginin dehidrolase Negatif 6 Lysine dekarboksilase Positif 7 VP Variable 8 Tumbuh pada suhu 420C Positif 9 Halophilik T1N0: positif; T1N3: positif;  T1N2: negatif 10 Sucrose Positif 11 Arabinose Negatif 12 ONPG Positif 13 Sensitifitas O/129 Sensitif (S) terhadap 10 µg & 150 µg 6.4 Pelaporan Laporkan ada (positif) atau tidak (negatif) Vibrio cholerae berdasarkan uji biokimia dan serologi.   Syarat mutu dan keamanan pangan hasil perikanan untuk bakteri Vibrio cholerae adalah negatif/25g.  7. Dokumentasi Instruksi Kerja Metode ini disimpan dalam bentuk berkas dan/atau file dalam komputer dengan status legalitas yang sama. Adapun formulir terkait yang digunakan dalam Instruksi Kerja Metode ini adalah  worksheet analis dan LHPS.