PEMERIKSAAN BAKTERI Salmonella

PEMERIKSAAN BAKTERI Salmonella

Tujuan Instruksi Kerja Metode ini sebagai pedoman laboratorium untuk mengidentifikasi bakteri pathogen Salmonella pada produk perikanan. 2.  Ruang lingkup a. Instruksi Kerja Metode ini meliputi pemeriksaan bakteri pathogen Salmonella dengan metode konvensional. b. Pemeriksaan bakteri pathogen Salmonella pada produk perikanan. 3.  Acuan SNI 01-2332.2-2006. Cara uji mikrobiologi-Bagian 2: Penentuan Salmonella pada produk perikanan. Badan Standarisasi Nasional. 4.  Bahan dan pereaksi a)  Bismuth sulfite Agar (BSA) b)  Urea agar   c)  Hectoen Enteric (HE) Agar   d)  Lactose Broth  (LB) e)  Lysine Decarboxylase Broth  f)  Lysine Iron Agar (LIA)   g)  Malonate Broth   h)  Motility Test Medium   i)  MR-VP Broth

4. Bahan dan pereaksi (lanjutan) j)  Phenol red Carbohydrate Broth   k)  Potasium Cyanide (KCN) Broth  l)   Rappaport-Vassiliadis (RV) medium   m) Selenite Cystine Broth (SCB)   n) Simmon Citrate Agar   o)  Tetrathionate Broth (TTB)  p)  Triple Sugar Iron (TSI) Agar  q)  Trypticase Soy -Tryptose Broth   r)  Ethanol 70% p)  Larutan Brillian Green Dye   q) Lart. Physiological Saline 0,85% dan Fomalinized Physiological Saline 0,85%   r)  Reagen Kovac’s    s)  Indikator Methyl Red   t) Tryptone (Tryptophane) Broth u)  Urea Broth   v)   Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar   w) Aquadest x) Larutan Potasium Hydroxide 40 %   y) Reagen VP   z) Larutan 1 N Sodium Hydroxide   aa) Larutan 1 N Hydrochloric Acid   bb) Salmonella Polyvalent Somatic O Antiserum cc) Salmonella Polyvalent Flagellar H Antiserum

5. Peralatan a)   Blender beserta plastik steril b)   Petridish . c)  Tabung reaksi. d)   Timbangan analitik e)   Inkubator f)  Jarum inokulasi g)  Autoclave h) Vortex mixer i)  Bunsen j)  Spatula k)  Filter apparatus l)   Oven m)  Hot plate dan stirer 6. Prosedur pelaksanaan 6.1   Persiapan contoh Contoh ikan ditimbang sebanyak 25 g, di-blender  secara aseptis, atau contoh cair sebanyak  25 ml, kemudian dimasukkan dalam wadah  steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth (LB), dikocok perlahan dan bila perlu tentukan pH sampai  (6,8  ±  0,2) sehingga terbentuk homogenat . Jika pH dibawah 6,6 , ditambahkan 1 N  NaOH steril, jika pH lebih dari 7,0 ditambahkan 1 N HCl.

6.2 Tahap analisa 6.2.1   Pra pengkayaan Homogenat (butir 6.1) lalu diinkubasi selama  24 jam  ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.  Dilanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur. 6.2.2  Pengkayaan a). Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, ambil 0,1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB).  Untuk jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam masing-masing 10 ml Selenite Cystine Broth (SCB) dan 10 ml TTB.    b). Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, inkubasi RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C; Inkubasi  TTB  selama 24 jam ± 2  jam pada suhu 43°C ± 0,2°C. Untuk jenis produk perikanan  lain,  inkubasi TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C. 6.2.3  Uji Presumtif Salmonella (seleksi pada media agar) a). Tabung  dikocok (dengan vortex) dan dengan menggunakan jarum loop (3mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam media HE, XLD dan BSA. b). Gores  ke dalam media yang  sama dari  RV Broth  atau SCB. c). Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. d). Diamati   kemungkinan adanya koloni  Salmonella

6.2.4   Pengamatan morphologi koloni  Salmonella  yang khas (typical) 1). Diambil  2 atau lebih koloni Salmonella dengan menggunakan jarum ose dari masing-masing media  agar selektif setelah 24 jam ± 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) adalah sebagai berikut: a).  HE Agar.  Koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur  Salmonella  membentuk koloni besar,  inti  hitam  mengkilat  atau  hampir  seluruh koloni terlihat berwarna hitam. b).  XLD Agar. Koloni merah jambu  (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur  Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat  berwarna hitam. c). BSA.  Koloni  coklat,  abu-abu  atau  hitam;  kadang-kadang  metalik.  Biasanya  media di sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam  (halo effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.   Koloni yang khas (typical) tumbuh pada  BSA  setelah  24  jam  ±  2  jam  inkubasi.   2).  Ambil koloni tersangka (typical)  dari ketiga media diatas dengan menggunakan jarum ose dan inokulasikan ke TSI agar dengan cara ditusuk ke dasar  lalu gores pada agar miringnya 3). Dari TSI tanpa mengambil koloni baru, gunakan jarum yang sama inokulasikan ke LIA dengan cara menusukkan ke dasar agar dulu baru gores pada agar miring.  4). Diinkubasi  pada media TSI  dan LIA selama  24  jam  ±  2  jam pada  suhu  35°C  ±  1°C dengan membiarkan tutup sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H2S yang berlebihan.

Koloni Salmonella   yang khas (typical) seperti Tabel 1. berikut : Tabel 1.  Reaksi biokimia Salmonella pada TSI  dan LIA Media Agar miring (Goresan) Agar tegak (tusukan) H2S TSI Alkalin/ K (merah) Asam/A (kuning) +/ - LIA Alkalin/ K (ungu) Alkalin/ K (ungu) +/ - a a  umumnya kultur Salmonella membentuk H2S pada LIA 5). Semua kultur yang memberikan reaksi alkalin pada tusukan agar tegak LIA, tanpa memperhatikan reaksi TSI, harus dipertimbangkan sebagai potensial Salmonella dan harus dilakukan uji biokimia dan serologi. 6). Kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak LIA dan asam baik pada goresan agar miring dan tusukan agar tegak pada TSI, dapat dinyatakan sebagai bukan Salmonella.  7). Dilakukan pengujian biokomia dan serologi terhadap kultur presumtif-positif TSI  untuk  menentukan  adanya  Salmonella.

6.2.5 Uji Konfirmasi 6.2.5.1 Uji biokimia dan serologi : 6.2.5.1.1 Uji biokimia: a). Uji urease Inokulasikan dari TSI tersangka dengan loop ke urea broth atau gores pada urea agar.  Inkubasikan 24 ± 2 jam pada suhu 35°C  ±  1°C. Reaksi spesifik Salmonella untuk uji urease memberikan hasil negatif (tidak terjadi perubahan warna). b) Uji citrat Inokulasikan dari TSI tersangka dengan loop  ke simon citrat agar, dengan cara digores.  Inkubasikan 96 ± 2 jam pada suhu 35°C  ±  1°C. Reaksi spesifik Salmonella untuk uji citrat memberikan hasil variable (menjadi biru/ tidak terjadi perubahan warna). c).  Uji   Lysine Decarboxylase Broth (LDB) Uji ini dilakukan hanya jika reaksi LIA meragukan. Ambil 1 ose dari TSI ke dalam media LDB. Kendurkan tutupnya   dan inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C±1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Salmonella memberikan reaksi alkalin ditandai dengan warna ungu pada seluruh media. Reaksi negatif ditunjukkan dengan warna kuning pada seluruh media. Jika hasil reaksi tidak menunjukkan warna kuning atau ungu, ditambahkan beberapa tetes 0,2% bromocresol purple dye dan amati perubahan warnanya. d).  Phenol red dulcitol 0,5%  Ambil 1  ose  dari  TSI  ke  dalam  media  dulcitol  Broth.  Kendurkan  tutupnya  dan inkubasi selama  48 jam ±  2 jam pada suhu  35°C  ± 1°C, tetapi amati setelah  24jam. Pada umumnya Salmonella memberikan hasil positif, ditandai dengan pembentukan gas dalam tabung durham dan  pH  asam  (kuning)  pada  media.

Reaksi negatif dulcitol ditandai dengan  tidak  terbentuknya  gas  pada  tabung  durham  dan  warna  merah  (phenol  red sebagai indikator). e). TB (Tryptone Broth) Dipindahkan  1 ose  dari TSI  ke  dalam media Tryptone Broth. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C dan selanjutnya ikuti prosedur di bawah ini: 1).  Potasium Cyanida (KCN) Broth Ambil 1 ose dari TB  24 jam kedalam media KCN Broth. Tutup tabung rapat-rapat dan dilapisi dengan kertas parafilm.  Diinkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu  35°C  ±  1°C  tetapi  amati  setelah  24  jam.  Hasil  positif  ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan  (ditandai dengan adanya kekeruhan). Salmonella tidak tumbuh pada media ini yang ditandai dengan tidak terjadinya kekeruhan (jernih). 2). Malonate Broth Ambil 1 ose dari TB 24 jam kedalam media Malonate Broth. Diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Kadang-kadang tabung Malonate Broth yang tidak diinokulasi berubah menjadi biru. Oleh karena   itu gunakan Malonate Broth sebagai kontrol. Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan reaksi negatif  (hijau atau tidak ada perubahan warna) pada broth ini. 3).  Uji Indol Ambil 5 ml TB  24 jam kedalam tabung kosong dan tambahkan  0,2 ml - 0,3 ml Reagent kovacs’. Amati segera setelah penambahan Reagen. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin merah pada permukaan media. Umumnya Salmonella  memberikan reaksi negatif  (tidak terbentuk cincin merah pada permukaan media).

f) Phenol red lactose broth. −   Ambil 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam -48 jam kedalam phenol red lactose  broth.  Diinkubasi selama 48 jam± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning),  Salmonella   memberikan   hasil   negatif   ditunjukkan  warna  merah  (phenolred sebagai indikator). g) Phenol red sucrose broth. −   Ambil 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam - 48jam kedalam Phenol red sucrose broth.  Diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.  Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning), Salmonella memberikan  hasil  negatif, ditunjukkan  warna  merah  (phenol red sebagai indikator). 6.2.5.1.2 Uji serologi a)  Uji serologi  Polyvalent  Somatic  (O) 1). Ambil 1 ose kultur dari TSI agar yang diinkubasikan selama 24 jam - 48 jam dan diletakkan diatas gelas preparat. 2). Tetesi dengan larutan saline 0,85% steril dan emulsikan.  3). Letakkan 1  tetes  Salmonella  Polyvalent  Somatic (O)  Antiserum  disamping suspensi koloni. Campurkan koloni Antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai  tercampur  sempurna. 4). Lakukan  kontrol  dengan  menggunakan  larutan  saline  dan Antiserum. 5). Miringkan campuran tersebut ke kiri dan ke kanan, dan amati segera pada latar belakang yang gelap. diamati hasil uji sebagai berikut : a)). Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol.

b)). Negatif apabila tidak terjadi penggumpalan baik pada larutan kultur maupun larutan kontrol. c)). Non spesifik apabila terjadi penggumpalan pada kedua uji campuran dan kontrol. b)   Uji serologi Polyvalent Flagellar (H) 1). Ambil 1 ose dari masing-masing TSI Agar yang memberikan reaksi Urease negatif kedalam: (a). 5 ml BHI Broth, dan diinkubasi selama  4 jam  -  6 jam pada suhu  35°C  ±  1°C sampai terlihat pertumbuhan (pada hari yang sama). Ditambahkan 2,5 ml larutan formanilized Physiological Saline ke dalam BHI Broth .  (b). 5 ml Tryticase soy -Tryptose Broth (TSTB) dan diinkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu  35°C  ±  1°C.  Ditambahkan  2,5  ml  larutan  formanilized  Physiological  Saline  ke dalam TSTB (untuk diuji pada hari berikutnya). (c ). Tambahkan 2,5 ml Formanilized Physiological  Saline  dan  uji  dengan  Salmonella  Polyvalent  Flagellar (H)  antisera. (d). Masukkan ± 0,5 ml larutan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera dalam tabung serologi 10 x 75 mm atau 13 x 100 mm. (e). Tambahkan 0,5 ml antigen yang akan diuji (butir  1  dan  2).  (f). Siapkan  kontrol  saline  dengan  mencampur         0,5ml formanilized Physiological  Saline  dengan 0,5 ml  formalinized  antigen.   (g). Inkubasikan  campuran tersebut  pada suhu 48°C - 50°C.  Diamati  setiap interval waktu 15 menit dan amati hasilnya selama1 jam. a)) Positif  apabila  terjadi  penggumpalan  dalam  uji  campuran  dan  tidak  ada penggumpalan dalam kontrol. b)) Negatif    apabila  tidak  ada  penggumpalan  dalam  uji  campuran  dan  juga kontrol. c)) Non spesifik apabila terjadi penggumpalan pada kedua uji campuran dan kontrol.

6.3 Interpretasi hasil:  a. Reaksi biokimia dan serologi untuk Salmonella tersaji pada Tabel 2. Tabel 2.   Reaksi biokimia dan serologi untuk Salmonella No Pengujian Hasil Reaksi Salmonella Reaksi spesies a Positif Negatif 1 Glucose (TSI) Tusukan kuning Tusukan merah + 2 Lysine Decarboxylase (LIA) Tusukan ungu Tusukan kuning + 3 H                                      (TSI & LIA) Hitam Tidak hitam + 4 Urease Warna ungu sampai merah Tidak ada perub. warna - 5 Lysine Decarboxylase Broth (LDB) Warna ungu Warna kuning + 6 Phenol red Dulcitol Broth Warna kuning dan/ atau gas Tidak ada gas dan warna tetap +b 7 KCN Broth Pertumbuhan Tidak ada pertumbuhan - 8 Malonate Broth Warna biru Tidak ada perub. warna -c 9 Uji Indol Warna violet pada permukaan Warna kuning pada permukaan - 10 Uji serologi valent Flagellar (H) Penggumpalan Tidak ada penggumpalan + 11 Uji serologi Polyvalent Somatic (O) Penggumpalan Tidak ada penggumpalan +

No Pengujian Hasil Reaksi Salmonella Reaksi spesies a Positif Negatif 12 Phenol red lactose Warna kuning dan/ atau gas Tidak ada gas dan warna tetap -c 13 Phenol red sucrose Warna kuning dan/ atau gas Tidak ada gas dan warna tetap - 14 Uji Voges Proskauer Merah muda sampai merah Tidak ada perub. warna - 15 Uji Methyl Red Warna merah menyebar Warna kuning menyebar + 16 Simmons citrate Ada pertumbuhan dan warna biru Tidak ada pertumbuhan dan warna tidak berubah v Dengan: a+, 90% atau lebih positif dalam 1 atau 2 hari; −, 90% atau lebih negatif dalam 1 atau 2 hari; v, variabel b Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Negatif C Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Positif b.Kriteria untuk pemisahan biakan  bukan  Salmonella. Tersaji pada Tabel 3. Tabel 3.   Kriteria untuk pemisahan kultur  bukan Salmonella No Pengujian Hasil 1 Urease Positif (warna ungu sampai merah) 2 Uji Indol  Positif (warna merah pada permukaan) 3 Polyvalent Flagellar (H) Negatif (tidak ada penggumpalan) 4 Lysine   Decarboxylase   Negatif (warna kuning) 5 KCN Broth Positif (ada pertumbuhan) 6 Phenol red lactose Positif  (warna kuning dan/ atau gas)a,b 7 Phenol red sucrose Positif (warna kuning dan atau gas)b 8 Uji Voges- Proskauer Uji Methyl Red Positif (merah muda sampai merah) Negatif (warna kuning menyebar) 1). Dilaporkan sebagai Salmonella kultur-kultur yang mempunyai reaksi seperti pada Tabel 2. 2). Dilaporkan sebagai bukan Salmonella kultur-kultur yang memberikan reaksi seperti pada Tabel 3.

7. Dokumentasi Instruksi Kerja Metode ini disimpan dalam bentuk berkas dan/atau file dalam komputer dengan status legalitas yang sama. Adapun formulir terkait yang digunakan dalam Instruksi Kerja Metode ini adalah  worksheet Analis dan LHPS.