PEMERIKSAAN BAKTERI Escherichia coli

PEMERIKSAAN BAKTERI Escherichia coli 

1.       Tujuan Instruksi Kerja Metode ini sebagai upaya untuk menentukan bakteri patogen Escherichia coli pada produk perikanan. 2.       Ruang lingkup a.    Instruksi Kerja Metode ini meliputi pemeriksaan jenis bakteri patogen  Escherichia coli dengan metode konvensional. b.   Pemeriksaan bakteri patogen  Escherichia coli  pada produk perikanan. 3.    Acuan SNI 01-2332.1-2006. Cara uji mikrobiologi-Bagian 1: Penentuan Escherichia coli  pada produk perikanan. Badan Standarisasi Nasional. Feng, P., Weagant, S. D., Grant,  M. A., and Burkhardt, W., 2002. Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. Bacteriological Analytical Manual. USFDA. 4.       Bahan dan pereaksi a)   Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered  (BFP/  larutan  KH2PO4) b)   Lauryl Sulfate  Broth   (LSB)  c)   EC Broth  d)   Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB ) agar e)   Plate Count Agar  (PCA agar) f)  Tryptone (Tryptophane) Broth (TB)  atau MIO medium f)    MR-VP Broth g)   Simmon Citrate Agar  h)   Pereaksi   pewarnaan  gram

5.       Peralatan a)   Inkubator 35oC ± 1oC; b)   Blender  yang dapat disterilisasi. c)   Botol pengencer; d)   Tabung durham; e)   Cawan petri ; f)   Tabung reaksi; g)   Timbangan analitik dengan ketelitian  0,0001 g; h)   Mikroskop; i)    Pipet 6.         Prosedur pelaksanaan 6.1   Persiapan contoh Contoh ikan ditimbang sebanyak 25 g, di-blender secara aseptis, atau contoh cair sebanyak  25 ml, kemudian dimasukkan dalam wadah atau plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phosphate Buffered.

6.2 Tahap analisa 6.2.1   Uji pendugaan coliform (presumptive coliform) a). Siapkan pengenceran 102 dengan cara melarutkan 1 ml larutan  101   ke dalam  9 ml larutan pengencer Butterfield’s Phosphate Buffered. b).  Ambil sebanyak 1  ml larutan  dari  setiap pengenceran ke dalam 3 seri tabung Lauryl Sulfate Broth (LSB) yang berisi tabung durham. c). Tabung-tabung  tersebut diinkubasikan selama 48 ± 2  jam  pada  suhu  35 ± 1oC.  Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. 6.2.2  Uji pendugaan Escherichia coli (presumtive  E. coli). a).  Inokulasikan dari setiap tabung LSB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung durham  dengan menggunakan jarum ose, Inkubasi EC Broth selama  48 ±  2  jam  pada  suhu  45 ±  0,5oC. b). Periksa tabung-tabung EC Broth tersebut diatas yang menghasilkan gas selama 48 ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

6.2.3 Uji Konfirmasi 6.2.3.1  Uji penegasan Escherichia coli  a).   Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose goreskan ke LEMB agar.  Inkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 35 ± 1oC. b).   Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. c).   Ambil satu koloni (typical saja) Escherichia coli   dari masing-masing cawan LEMB  dan  goreskan  ke  media  PCA  miring  dengan  menggunakan  jarum  ose.  Inkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 35 ± 1oC. 6.2.3.2  Uji biokimia (1).  Produksi indol ( i ) Ambil 1 ose dari  PCA miring (butir 6.2.3.c) diinokulasikan ke dalam Tryptone Broth atau MIO medium, inkubasi selama 24 ± 2  jam  pada  suhu 35 ± 1oC.  Uji Indol  dilakukan  dengan  menambahkan 0,2 ml  -  0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

(2).   Uji voges  proskauer (VP) dan  uji  methyl red (MR) Ambil 1 ose dari PCA  miring (butir 6.2.3.c) miring diinokulasikan ke dalam MRVP Broth. Inkubasi selama 24 ± 2 atau tunggu hingga  48 ± 2 jam pada suhu 35± 1oC. Uji VP dengan menggunakan reagen VP barrit (1-Naphtol & KOH 40%). Sedangkan uji MR dengan indikator methyl red. Hasil uji VP positif ditandai dengan warna merah muda atau mirah delima (ruby), negatif tidak ada perubahan warna, sedangkan hasil uji MR positif ditandai dengan warna merah, negatif tidak ada perubahan warna atau warna kuning,   (3)   Uji sitrat (C) Goreskan 1 ose dari PCA miring (butir 6.2.3.c) ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 24 ± 2 atau tunggu hingga 48 ± 2 jam pada suhu 35 ± 1oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. (4) Produksi gas dari laktosa Ambil 1 ose dari PCA miring (butir 6.2.3.c) diinokulasikan kedalam Laktosa. Inkubasi selama 24 ± 2 atau tunggu hingga 48 ± 2 jam pada suhu 35 ± 1oC reaksi positif jika warna kuning,negatif jika warna tetap atau merah

6.2.3.3 Uji morfologi Dilakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli  terduga. Biakan diambil dari PCA miring  (butir 6.2.3.c) yang telah diinkubasi selama 24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli  termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek. 6.3 Interpretasi hasil Tabel   1. Interpretasi hasil Kriteria Biotipe 1 Biotipe 2 Gas pada tabung LSB + + Indol + - MR + + VP - - Citrat - - Uji Morfologi Gram negatif, bentuk batang pendek Gram negatif, bentuk batang pendek 6.4 Pelaporan Berdasarkan Tabel 1. Interpretasi hasil di atas, nyatakan Escherichia coli dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Lihat Tabel 2. menggunakan 3 seri tabung  pengenceran.  Syarat mutu dan keamanan pangan hasil perikanan untuk bakteri pathogen E. coli < 3 APM /g.  Jika tidak memenuhi syarat  mutu dan keamanan pangan hasil perikanan untuk bakteri pathogen Escherichia coli maka ditulis sesuai Tabel Indeks APM. 7. Dokumentasi Instruksi Kerja Metode ini disimpan dalam bentuk berkas dan/atau file dalam komputer dengan status legalitas yang sama. Adapun formulir terkait yang digunakan dalam Instruksi Kerja Metode ini adalah  worksheet analis dan LHPS.

Tabel 2.  Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif dari 3 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2 dan 10 3. Tabung positif APM/g Tingkat kepercayaan Tabung  positif APM/g Tingkat kepercayaan 101 102 103 Bawah Atas 101 102 103 Bawah Atas 0 0 0 <3,0 - 9,5 2 2 0 21 4,5 42 0 0 1 3,0 0,15 9,6 2 2 1 28 8,7 94 0 1 0 3,0 0,15 11 2 2 2 35 8,7 94 0 1 1 6,1 1,2 18 2 3 0 29 8,7 94 0 2 0 6,2 1,2 18 2 3 1 36 8,7 94 0 3 0 9,4 3,6 38 3 0 0 23 4,6 94 1 0 0 3,6 0,17 18 3 0 1 38 8,7 110 1 0 1 7,2 1,3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3,6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7,4 1,3 20 3 1 1 74 17 200 1 1 1 11 3,6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3,6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4,5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4,5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9,2 1,4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3,6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4,5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3,7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4,5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8,7 94 3 3 3 >1100 420 -- SUMBER : Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 8th edition, 1998